Léonard dans ses années de maturité, ne cesse de revenir sur le thème de la Vierge, sainte Anne et l’enfant Jésus. Après le carton de Londres qui en est la première version, il en esquisse un second, en 1501 —aujourd’hui disparu —, et un troisième encore — disparu lui aussi — que l’on connaît par la description de Vasari.
    La peinture inachevée du Louvre est la quatrième et dernière tentative de Léonard pour transposer ce sujet religieux. Il commence de peindre le tableau vers 1508, sans doute à partir du second carton de 1501. Concernant ce carton, fra Pietro da Novellara, nous donne dans sa correspondance avec Isabelle d’Este, un renseignement précieux: il explique que la Vierge cherche à retenir le Christ, comme pour l’éloigner de l’agneau avec lequel il joue — L’agneau symbolise la Passion, les souffrances du Christ — tandis que sainte Anne, qui connaît la mission de l’enfant divin, empêche sa fille d’accomplir le geste. Cependant la Sainte Anne du Louvre a été dépouillée de la dimension tragique qui a saisi fra Pietro à la vue du second carton et qui nous émerveille dans le carton de Londres. Car si dans le tableau du Louvre, la Vierge se penche vers l’Enfant Jésus avec une tendre sollicitude, elle ne semble pas vouloir l’empêcher de chevaucher l’agneau. De son côté, sainte Anne, qui a perdu son rôle de prophétesse, « observe avec bonheur sa progéniture terrestre devenue divine ». Ces mots que Vasari emploie pour décrire la sainte Anne du troisième carton, s’appliquent également parfaitement à la sainte Anne du tableau. Léonard aurait-il utilisé les trois cartons pour sa composition finale? Quoi qu’il en soit, la Vierge, sainte Anne et l’Enfant Jésus n’en reste pas moins une pure icône, formelle et abstraite.
    Le paysage est brossé d’un pinceau d’une délicatesse infinie et la transparence des couleurs a quelque chose de magique. En dépit de la description géologique précise qu’il fait dans ce tableau, on sent chez Léonard un goût pour l’étrange. Certes les tours et les flèches des montagnes lointaines sont inspirées des Dolomites que Léonard connaît bien, mais là, elles semblent flotter dans une atmosphère vaporeuse, comme suspendues dans le temps, immobiles et immortelles. Cette vision cosmique prête à la scène un caractère surnaturel, prophétie allégorique du destin du Christ: « l’Agneau de Dieu qui enlève les péchés du monde. »
    L’attribution à Léonard de ce tableau a parfois été mise en doute. De fait, l’Enfant Jésus et peut-être la tête de la, qui Vierge qui pourrait être de la main d’Ambrogio de Predis, ne sont pas de la même facture que le reste. Néanmoins, cette composition d’une beauté saisissante, avec ce paysage surgi de l’au-delà, cette sainte Anne au mystérieux sourire et cette extraordinaire et unique construction pyramidale, ne saurait être l’œuvre d’aucun autre peintre que Léonard.